产品概述
本产品是一种化学成分明确、无人和动物血清、无任何动物成分的培养基，适用于人外周血、脐带血、骨髓等来源NK细胞的培养扩增。产品中所有蛋白质成分均为重组技术获得，包括重组人白蛋白、重组人转铁蛋白等多种成分。产品不含任何抗生素。
激活剂，为特异性活化NK细胞而设计。含有特殊的活性物质，鲎试剂法测定热源两者均为阳性（≥0.5U/ml，鲎试剂法）。然而，在培养过程中，该成分不会存在于细胞终产品中，因此，细胞产品热源测定应为阴性。
使用该套装，培养起始细胞可以为外周血、胎盘/脐带血或骨髓单个核细胞。一般而言，使用该套装培养14天，细胞总数扩增100倍以上，CD56+细胞比例超过80%，最高可达到97%。
激活剂4°C储存，有效期6个月。人NK细胞优势扩增培养基4°C储存，有效期12个月。重组人IL-15应于 4°C保存，有效期为24个月。
所有成分均应避光保存，不宜剧烈震荡，以免大分子物质因变性而失活。
技术指标
（一） NK优势扩增培养基
1. 浅红色，透明，pH7.1-7.4
2. 细菌培养（阴性）
3. 真菌培养（阴性）
4. 热源（鲎试剂法）≤0.25U/ml
5. NK92细胞生长：良好
（二） 激活剂
1. 浅白色，半透明
2. 细菌培养（阴性）
3. 真菌培养（阴性）
（三）重组人IL-15
1.白色粉末
2.细菌培养（阴性）
3.真菌培养（阴性）
产品规格
产品货号 | 名称 | 规格 | 储存条件 | 运输条件 |
1002A | NK激活剂 | 1ml×2 | 4°C | 冰袋 |
1008 | 重组人IL-15 | 100ug | 4°C | 冰袋 |
1002C | 人NK优势扩增培养基 | 1000ml×2 | 4°C | 冰袋 |
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产品优势：
该款培养基是一种化学成分明确、无人和动物血清的培养基，属于animal component free级别。使用该培养基无需任何肿瘤细胞系作为滋养层，即可满足脐带血、外周血、骨髓来源NK细胞的扩增，培养2周NK细胞扩增1000倍以上，从而为NK细胞免疫治疗临床应用提供了安全性和有效性保障。
应用举例
外周血来源单个核细胞
图1 培养中的NK细胞之培养48小时细胞状态(标示：Bar:100 μm)
将外周血单个核细胞，按照说明书的方法，在Clin-SFM®-NK体系中培养48小时，可见多个由十数个细胞组成的簇（cluster），尤其是在培养瓶边缘处多见。
依据我们的经验，在培养早期，这种贴壁的簇主要由NK细胞组成。如果在培养早期出现较多悬浮的簇或集落（colony），提示T淋巴细胞扩增显著，可能影响最终收获时NK细胞的比例。
图2 培养中的NK细胞之培养7天细胞状态(Bar:100μm)。
将外周血单个核细胞，按照说明书的方法，在Clin-SFM®-NK体系中培养一周时，贴壁的簇或集落逐渐脱壁，悬浮于培养液中。
根据我们的经验，如果10×10视野中，较大集落超过3个，或培养基变黄，提示应该补液。
图3 NK细胞之培养7天流式检测结果
收获人外周血单个核细胞，按照试剂盒提供的方法培养一周后，收集细胞进行抗人CD3-FITC和抗人CD56-PE标记，FACSCalibur收集数据，Flowjo软件分析。可见主要为三群细胞，分别是NK细胞(CD3-/CD56+)、T淋巴细胞(CD3+/CD56-)和多种细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK，CD3+/CD56+)。
将外周血单个核细胞，按照说明书的方法，在Clin-SFM®-NK体系中培养7天时，多数情况下，NK细胞(CD3-/CD56+)比例在30-70%之间。但是，在某些情况下(如肿瘤病人外周血NK培养)，培养一周时以CD3+/CD56+细胞为主，比例可在40%左右。随着培养时间的延长，CD3和CD56双阳性比例下降，CD3-/CD56+细胞比例逐渐上升。
图4 NK细胞之培养14天流式检测结果
将外周血单个核细胞，按照说明书的方法，在Clin-SFM®-NK体系中培养14天时，收集细胞进行流式细胞学分析。可见细胞群体中以NK细胞(CD3-/CD56+)为主。
在多数情况下，NK细胞(CD3-/CD56+)比例在80%以上，最高可达97%。然而，少数情况下(如肿瘤病人外周血NK细胞培养)，CD56阳性细胞比例虽可达到80%以上，但多数细胞同时表达CD3和CD56(如下图所示)。出现这种现象的原因未明，也值得进一步探讨。
图5 外周血培养2周时流式细胞学分析结果
抽取某一肝癌患者(男，61岁)外周血，进行单个核细胞分离，按照试剂盒操作说明进行培养2周，FCM分析发现，细胞群体中以多种细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK，CD3+/CD56+)为主。
产品概述
本产品是一种化学成分明确、无人和动物血清、无任何动物成分的培养基，适用于人外周血、脐带血、骨髓等来源NK细胞的培养扩增。产品中所有蛋白质成分均为重组技术获得，包括重组人白蛋白、重组人转铁蛋白等多种成分。产品不含任何抗生素。
激活剂是为特异性活化NK细胞而设计。激活剂中含有特殊的活性物质，鲎试剂法测定热源两者均为阳性（≥0.5U/ml，鲎试剂法）。然而，在培养过程中，该成分不会存在于细胞终产品中，因此，细胞产品热源测定应为阴性。
使用该套装，培养起始细胞可以为外周血、胎盘/脐带血或骨髓单个核细胞。一般而言，使用该套装培养14天，细胞总数扩增100倍以上，CD56+细胞比例超过80%，最高可达到97%。
激活剂4°C储存，有效期6个月。NK细胞筛选扩增培养基均4°C储存，有效期12个月。
所有成分均应避光保存，不宜剧烈震荡，以免大分子物质因变性而失活。
技术指标
（一） 激活剂
1. 浅白色，半透明
2. 细菌培养（阴性）
3. 真菌培养（阴性）
（二） NK优势扩增培养基
1. 浅红色，透明，pH7.1-7.4
2. 细菌培养（阴性）
3. 真菌培养（阴性）
4. 热源（鲎试剂法）≤0.25U/ml
5. NK92细胞生长：良好
产品规格
产品货号 | 描述 | 规格 | 储存条件 | 运输条件 |
1002A | 激活剂 | 1ml×2 | 4°C | 冰袋 |
1008 | IL-15 | 100ug | 4°C | 冰袋 |
1002C | NK优势扩增液 | 1000ml×2 | 4°C | 冰袋 |
操作方法
本操作方法以采集30-50 ml外周血为例，介绍NK细胞诱导扩增培养的具体方法。请仔细阅读操作手册，尤其注意每个提醒事项。
1. 培养瓶铺板
（1） 建议使用适于贴壁细胞培养的培养瓶，如由Corning公司生产、底面积为75cm2或175cm2的培养瓶。
（2） 将激活剂（1 ml）置于37°C复温10 min，轻轻混匀。
（3） 培养瓶（175 cm2,Corning）加入激活剂2.0 ml，生理盐水8ml，混匀。或者，按照下表提供的参数，使用其它培养瓶铺板。应提前至少24h铺板，也可将铺好的培养瓶置于4°C，可储存2周。
（4） 可参考以下表格，包被其它型号的培养瓶。
培养瓶（底面积） | 25 cm2 | 75 cm2 | 175 cm2 | 225 cm2 |
激活剂体积 | 1000 ul | 2000 ul | 3.0ml | 4.0 ml |
生理盐水 | 5 ml | 10 ml | 20 ml | 30 ml |
2. 单个核细胞分离、血浆采集及处理
1) 开启水浴箱，调整温度至56 °C，以备灭活补体用。
2) 常规无菌采集抗凝外周血，肝素抗凝。
3) 分离单个核细胞前，将已经预铺板的培养瓶放置37°C。
4) 常规Ficoll-Hypaque密度梯度离心。建议关闭离心机刹车（brake off）。
5) 吸取上层稀释的血浆，56 °C，30 min灭活补体，之后立即置于-20°C静置2 min，离心（3000 g,15-30 min）以去除血小板。
6) 收取单个核细胞层，生理盐水充分混匀。离心洗涤。
7) 生理盐水悬浮细胞沉淀，再次离心洗涤。
8) 使用NK细胞扩增培养基悬浮细胞。计细胞数。
3. 细胞培养
1) 取出已经预铺板且置于37°C孵育的培养瓶，吸净稀释的激活剂。沿培养瓶侧壁加入少量生理盐水，轻轻洗涤瓶底。吸除。
2) 根据细胞计数结果，将细胞终浓度调整为3×106/ml。单个核细胞悬液中加入IL-2，IL-15和自体血浆，自体血浆终浓度为10%，IL-2和IL-15终浓度分别为1000U/ml及50ng/ml。
细胞浓度以及接种培养瓶的表面积，是决定最终培养NK细胞比例的两个关键因素。我们推荐细胞密度在3×106/ml左右，同时，根据接种细胞体积选择适宜底面积的培养瓶。下表可作为参考。
培养瓶（底面积） | 25 cm2 | 75 cm2 | 175 cm2 | 225 cm2 |
细胞悬液总体积 | 2.5-5 ml | 7.5-10 ml | 15-20 ml | 25-30 ml |
细胞总数 | 0.75-1.5×107 | 2-3×107 | 4.5-6×107 | 7.5-9×107 |
3) 将细胞悬液加入已经预铺板的培养瓶中，37°C，5% CO2和100%湿度下培养。次日，观察是否有污染现象；如无，继续培养96小时。
4) 96小时后补充新鲜培养基。新鲜培养基含IL-2（2000 U/ml）、IL-15（100 ng/ml）和自体血浆2.5-5%。一般情况下，补充液体量为原体积的一倍。
5) 继续培养。培养液变黄后，补充新鲜培养基。新鲜培养基含血浆5%，IL-2（1000 U/ml）和IL-15（50 ng/ml）。补液量一般为补液前原体积的1倍。细胞应在预铺板的培养瓶中培养至少一周。
6) 当原瓶培养基变黄、总体积接近或达到培养瓶最大体积时，添加等量含血浆5%，IL-2（1000 U/ml）和IL-15（50 ng/ml）的培养基，并分瓶培养。
NK细胞集落常贴壁，可以通过以下方法使贴壁集落悬浮：（1）轻轻拍打培养瓶侧壁，使贴壁的集落悬浮；（2）或通过吸管吹打，使贴壁的集落悬浮；（3）如仍有较多集落贴壁，则将细胞悬液转移至新的培养瓶后，加入需要补充的冷新鲜培养基，置于超净台中5min，之后轻轻拍打培养瓶侧壁，则大部分集落可脱落，与其它细胞混合后培养。
7) 按照50-100 ml/瓶（225 cm2），将细胞扩增转移至新培养瓶，原瓶中加入适量新鲜培养基，继续培养。或者，将所有细胞悬液直接转培养袋培养。
8) 每天观察培养基颜色、细胞集落大小及细胞密度，及时补充含血浆、IL-2和IL-15的新鲜培养基，新鲜培养基总量为原来体积（等量补液）。每次补液前，轻轻拍打培养瓶侧壁，使贴壁的集落悬浮。一般而言，每天或每2天需要补充新鲜培养基。
9) 培养12-15天，细胞数达到目的用量后，可进行质量检验，之后收获细胞。
4. 细胞收获
1) 将细胞转移至500 ml离心管，计细胞数及细胞活力。
2) 离心收获细胞，速度为500 g，时间为15 min。
3) 将细胞转移至250 ml离心管，生理盐水悬浮，离心洗涤，500 g，15 min。
4) 将细胞转移至50 ml离心管，生理盐水悬浮，离心洗涤，500 g，10 min。
5) 用含1%注射用人白蛋白的生理盐水悬浮细胞。
6) 使用孔径为70 μm的细胞筛（cell strainer）过滤细胞。
7) 留小样备质检。
8）将细胞转移至输液袋中。静置于室温。
5. 注意事项
（1）预铺板时间要长，至少过夜，或铺板后密闭培养瓶瓶口，4 °C最长可储存2周。
（2）初始接种体积不易过大，最大量为30 ml/225 cm2培养瓶，20 ml/175 cm2培养瓶，10 ml/75 cm2培养瓶，5 ml/25 cm2培养瓶。将单个核细胞在原培养瓶中培养超过1周，常可达到较好的效果。
（3）自体血浆制备过程中去除血小板要彻底，过多的血小板会影响NK细胞活化。自体血浆不够或不适宜培养时，可用人AB混合血浆。将多份（建议5份以上）人AB血浆冻融后混合，离心（3000g，至少15 min）去除血小板，并添加注射用肝素钠10 U/ml，以防形成凝胶。
