产品优势：
该款培养基包括基础培养基和添加剂两部分。基础培养基中含有多种氨基酸、微量元素等，已添加Hepes和L-谷氨酰胺。添加剂中含有多种细胞因子和重组人白蛋白等成分。可有效的维持体外培养的间充质干细胞的干性及功能性，为基础及临床研究提供了安全性和有效性的保障。
应用举例
采用酶消化法从健康脐带组织华通氏胶中分离MSC，全程采用本培养基及附带的添加剂培养，无血清或其他成分添加。记录细胞形态变化（图1-4）并检测表面标志（图5）。
图1 消化法原代培养的人脐带组织MSC(Day3)(Bar:100 μm)
原代细胞培养3天后，PBS洗涤去除未贴壁细胞，可见大量贴壁细胞，均匀分布，形状近似梭形。
图2 P1代人脐带组织MSC(Bar:100 μm)
原代细胞80%融合后胰酶消化，按1：3传代，传代后第三天拍照，可见细胞呈细梭形，胞体折光性好，分裂相多，背景干净。
图3 P5代人脐带组织MSC(Bar:100 μm)
细胞传至第5代，细胞形态仍为长梭形，未发生肥大、颗粒化等现象，细胞增殖活跃，仍处于良好生长状态。
图4 P9代人脐带组织MSC(Bar:100 μm)
传代至第9代时，细胞仍保持较好的增殖状态。细胞凸起略变长，但仍保持梭形，没有出现肥大、颗粒化现象。
CONTROL
CD31-FITC-CD44-PE
CD45-FITC/CD73-PE
CD29-PE
图5 P5代人脐带组织MSC表型流式分析。流式结果显示，P5代细胞99%以上具有MSC典型表面标志特征（CD45-,CD31-,CD73+,CD44+）
产品概述
本产品适用于人间充质干细胞体外培养，尤其适用于脐带、胎盘和脂肪组织来源提取的间充质干细胞的培养，包括基础培养基和添加剂两部分。基础培养基中含有多种氨基酸、微量元素等，已添加Hepes和L-谷氨酰胺。添加剂中含有多种细胞因子和重组人白蛋白等成分。为保障活性，建议添加剂部分一次解冻后分装再冻存，不宜反复冻融。
技术指标
（一）基础培养基
1．物理性状：红色，澄清透明。pH 7.1-7.4
2．细菌培养：阴性
3．真菌培养：阴性
4．热 源：≤0.25 U/ml
5．细胞生长：良好
（二）添加剂
1．物理性状：黄色透明。pH 6.0-7.0
2．热 源：≤0. 25 U/ml
3．细胞生长：良好
微生物检测项目：
检测项目名称 | 检测方法 | 检测结果 | 单位 | 参考值 |
EB病毒 | 核酸扩增荧光定量 | ＜5.00E+02 | copies/mL | ＜5.00E+02 |
巨细胞病毒 | 核酸扩增荧光定量 | ＜5.00E+02 | copies/mL | ＜5.00E+02 |
乙型肝炎病毒 | 核酸扩增荧光定量 | ＜1.00E+02 | IU/mL | ＜1.00E+02 |
丙型肝炎病毒 | 核酸扩增荧光定量 | ＜5.00E+01 | IU/mL | ＜5.00E+01 |
解脲支原体 | 核酸扩增荧光定量 | 阴性 |
| 阴性 |
单纯疱疹病毒II型 | 核酸扩增荧光定量 | 阴性 |
| 阴性 |
沙眼衣原体 | 核酸扩增荧光定量 | 阴性 |
| 阴性 |
解脲支原体 | 培养 | 阴性 |
| 阴性 |
肺炎支原体 | 培养 | 阴性 |
| 阴性 |
细菌 | 培养 | 阴性 |
| 阴性 |
真菌 | 培养 | 阴性 |
| 阴性 |
艾滋病抗体/P24抗原 | ELISA | 阴性 |
| 阴性 |
梅毒特异性抗体 | ELISA | 阴性 |
| 阴性 |
肺炎支原体抗体 | ELISA | 阴性 |
| 阴性 |
产品规格
产品货号 | 名称 | 规格 | 储存条件 | 运输条件 |
1001A | 人MSC培养基础培养基 | 500 ml | 4 °C | 冰袋 |
1001B | 人MSC添加剂 | 25 ml | -20 °C | 干冰 |
操作方法
一、完全培养基的配制
将添加剂（25 ml）室温或2-8 °C过夜融化，加入500 ml基础培养基中，即为完全培养基。为维持添加剂中细胞生长因子的活性，请将配制的完全培养基置于4 °C避光保存，储存时间不宜长于4周，2周内用完最佳。
二、人骨髓间充质干细胞培养
1、 将骨髓样品制备成单细胞悬液，推荐使用密度梯度离心法获得单个核细胞进行以下实验。
★ 注意：人骨髓单个核细胞的分离，可采用Ficoll-Hypaque（比重1.077 g/ml），或Percoll（比重1.073 g/ml）。后者毒性小，且分离细胞纯度较好。
2、 PBS或基础培养基清洗细胞两次。
★ 注意：两次离心速度不同。第一次收集的细胞悬液中含有Ficoll-Hypaque或Percoll，应加足量PBS稀释，离心速度高。第二次离心时，可用常规速度沉降细胞。
3、 弃上清，用完全培养基重悬细胞。
4、 细胞计数，调整细胞浓度为5-7.5×106 /ml。
5、 根据拟采用培养瓶或皿的底面积，计算接种细胞总量。一般而言，细胞来源不同，接种密度可适当调整， 5-10×105 /cm2适于多数情况下人骨髓间充质干细胞的培养。如细胞来源于粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员的骨髓或经胶原酶消化的骨髓小粒，接种密度可较低；如细胞来源于化疗后骨髓或老年人，细胞接种密度可达1.0×106 /cm2。
6、 将接种好的细胞于条件为温度37 °C、CO2浓度5%、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养。根据细胞生长状况换液。
★ 注意：一般文献推荐培养48小时后去除非贴壁细胞。然而，根据我们的专利技术，骨髓单个核细胞培养48小时后，将贴壁细胞与非贴壁细胞分别培养，两种体系都收获的骨髓MSC数量相近。因此，我们强烈推荐：单个核细胞接种次日观察有无污染；如无污染现象，可持续培养5-7天，或至培养基变黄。之后，去除非贴壁细胞，加入新鲜的完全培养基继续培养，常可获得更多的间充质干细胞。
三、人脐带间充质干细胞培养
1. 按照常规方法分离人脐带Walton胶中的细胞。
★ 注意：从脐带组织中分离细胞的方法，严重影响最终所得细胞纯度和质量。脐带组织中含有内皮细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、外膜细胞、间充质干细胞乃至单核巨噬细胞等。以上细胞均可贴壁，有些生长速度也较快，且细胞也多呈纺锤形。更有趣的是，部分细胞也表达CD29，CD44，CD73等表面标记。这些细胞不易与间充质干细胞区分。建议使用酶消化法进行脐带间充质干细胞的分离，以保障所得细胞纯度。
2. PBS清洗细胞1次。
3. 弃上清，用完全培养基重悬细胞。
4. 细胞计数，调整细胞浓度为5×106 /ml。
5. 根据拟采用培养瓶或皿的底面积，计算接种细胞总量。一般而言，一根正常的脐带，经消化后可接种于2-4个直径为150 mm的培养皿。
6. 将接种好的细胞置于5% CO2和饱和湿度的37 °C培养箱培养。根据细胞生长状况换液。
★ 注意：一般文献推荐培养48小时后去除非贴壁细胞。我们建议：培养次日观察有无污染；如无污染现象，可持续培养5-7天，或至培养基颜色变黄。之后，去除非贴壁细胞，加入新鲜的完全培养基继续培养。
四、脂肪间充质干细胞的分离
1. 人脂肪组织来自脂肪抽吸患者的废弃脂肪组织。
2. 无菌PBS反复漂洗除菌。
3. 将脂肪组织转移至50 ml或250 ml离心管，加入等体积的使用alpha-MEM配制的胶原酶I溶液，使其终浓度达到0.1%（重量/体积）。
4. 37 °C，摇床（120rpm）消化2小时以上。
5. 室温静置10 min，吸除上层油滴。
6. 离心，800 g，10 min，收集消化细胞。
7. PBS洗涤一次，500 g，10 min。MSC无血清完全培养基悬浮细胞。
8.计细胞数，调整细胞浓度，按照5.0×105-1.0×106 /cm2底面积接种。
9.次日观察，如无污染，继续培养至培养基颜色变黄，或贴壁细胞密度达到30%以上。补充新鲜的MSC无血清完全培养基。
10. 细胞密度达到80%左右时，按照以下步骤传代培养。
五、间充质干细胞的换液
吸去旧的间充质干细胞的完全培养液，加入足量新鲜的预热至37 °C的间充质干细胞完全培养液。
换液时间：当间充质干细胞的完全培养液变酸（培养液的颜色变黄），而且此时细胞尚未达到80%融合，则应该予以换液。一般来说，间质干细胞的换液间隔为3-4天。
六、间充质干细胞的传代
间充质干细胞生长至80％融合时，就应该按照下面步骤进行传代。
★注意：为维持间充质干细胞的多向分化能力和增殖能力，强烈建议细胞达80%时即进行传代培养。如细胞密度过大，细胞会出现自发分化现象，表现为细胞大小不一，I型胶原等胞外基质分泌量明显增加，导致使用胰蛋白酶消化时，细胞成片脱落，最终收获的细胞数反而下降。因此，不可让间充质干细胞完全融合或过度融合，这将严重影响细胞传代后的生长状态。
1. 吸去培养液。
2. 用1×PBS洗涤细胞2次，以去除残留的培养液。
★注意：使用无血清体系培养的间充质干细胞，其贴壁能力远不及血清培养细胞。因此，如用培养皿培养，建议沿培养皿的侧壁缓缓加入PBS；如用培养瓶培养，建议沿培养瓶的上壁加入PBS，以免细胞脱落，影响收获细胞数。
3. 加入PBS，之后加入0.25％ Trypsin-0.02% EDTA，PBS与胰蛋白酶体积比为4:1，两者总量以覆盖培养皿或培养瓶表面为宜。轻轻旋转，置37 °C培养箱中消化3－5分钟。用手轻拍培养器皿的侧壁，显微镜下可见绝大部分细胞变圆，极少量细胞贴壁仍呈纺锤形，极少量细胞已经悬浮即可终止消化。依据不同批次胰蛋白酶活性不同，消化的时间以显微镜下观察细胞变圆为准，但是，推荐消化时间不低于3分钟。
★注意：对于人间充质干细胞，尤其是利用该体系培养的细胞而言，其消化脱壁的时间应该较短，难以消化脱壁的细胞多数可能不是间充质干细胞，而是其他的杂细胞。在原代培养第一次传代时，尤其注意消化时间；如将所有细胞收获，其中必然含有单核巨噬细胞等杂细胞。
4. 立即加入等体积的间充质干细胞完全培养液，用吸管吸取液体，反复吹打培养器皿底壁，使细胞彻底脱离瓶/皿底壁。
★注意：吹打时动作不宜太猛，不要产生气泡。对于一个细胞而言，气泡的张力很大，气泡的破裂足以杀死周围的细胞，使细胞内基因组DNA释放，细胞呈粘稠的团状物，严重影响了收获数量和质量。
5. 离心（250 g，5 min），吸去上清液。
6. 用2－3 ml间充质干细胞的完全培养液重悬细胞。
7. 按照6000个细胞/cm2的密度来接种细胞。
★注意：一般而言，早期代次（1-3代）MSC按照1:3-5传代，5代以后的细胞以1:2传代较好。
8. 加足够的间充质干细胞的完全培养液，在37 °C，5％CO2和饱和湿度的培养箱中培养。
七、 间充质干细胞冻存
1. 细胞消化和计数，用胰酶对待冻存的细胞进行消化，并对细胞进行计数。
2. 500 g，离心5-8 min，去掉上清。
3. 根据细胞计数的情况，加入适量的冻存液，使细胞密度在1×106/ml左右（或根据自己希望达到的细胞密度）。
4. 轻轻地重悬细胞（务必重悬均匀），将重悬的细胞按等份加入到灭菌的冻存管（需提前做好标记或者贴上标签）中，旋紧冻存管盖。
5. 将冻存管放入程序降温冻存盒中，然后将冻存盒直接放入-80 °C。
6. 第二天将细胞从-80 °C转移到液氮中。
八、间充质干细胞复苏
1.配制人间充质干细胞无血清完全培养基，放入37 °C水浴中预热，离心管中加入预热的适量培养基；
2.从液氮中取出间充质干细胞迅速放入37 °C水浴快速解冻；
3.将复苏细胞滴加入预热的完全培养基中，500 g离心5-8 min；
4.弃上清，加入适量完全培养基，将培养瓶置于37 °C，5% CO2、饱和湿度的无菌恒温培养箱中培养。
