产品概述
本产品是一种化学成分明确、无人和动物血清、无任何动物成分的培养基，适用于人外周血、脐带血、骨髓等来源CIK细胞的培养扩增。产品中所有蛋白质成分均为重组技术获得，包括重组人白蛋白、重组人转铁蛋白等多种成分。产品不含任何抗生素。
激活剂，为特异性活化CIK细胞而设计。激活剂中含有特殊的活性物质，鲎试剂法测定热源两者均为阳性（≥0.5U/ml）。然而，在培养过程中，该成分不会存在于细胞终产品中，因此，细胞产品热源测定应为阴性。
使用该套装，培养起始细胞可以为外周血、胎盘/脐带血或骨髓单个核细胞。一般而言，使用该套装培养14天，细胞总数扩增100倍以上，CD3+/CD56+细胞比例超过30%，CD56+细胞可达到50%以上。
激活剂4°C储存，有效期6个月。CIK细胞优势扩增培养基均4°C储存，有效期12个月。重组人IL-15应于 4°C储存，保质期24个月。
所有成分均应避光保存，不宜剧烈震荡，以免大分子物质因变性而失活。
技术指标
（一） CIK优势扩增培养基
1. 浅红色，透明，pH7.1-7.4
2. 细菌培养（阴性）
3. 真菌培养（阴性）
4. 热源（鲎试剂法）≤0.25U/ml
5. NK92细胞生长：良好
（二） 激活剂
1. 浅白色，半透明
2. 细菌培养（阴性）
3. 真菌培养（阴性）
（三）重组人IL-15
1.白色粉末
2.细菌培养（阴性）
3.真菌培养（阴性）
产品规格
产品货号 | 名称 | 规格 | 储存条件 | 运输条件 |
1003A | CIK激活剂 | 1ml | 4°C | 冰袋 |
1008 | 重组人IL-15 | 100ug | 4°C | 冰袋 |
1003 | 人CIK优势扩增培养基 | 1000ml×2 | 4°C | 冰袋 |
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产品概述
本产品是一种化学成分明确、无人和动物血清、无任何动物成分的培养基，适用于人外周血、脐带血、骨髓等来源CIK细胞的培养扩增。产品中所有蛋白质成分均为重组技术获得，包括重组人白蛋白、重组人转铁蛋白等多种成分。产品不含任何抗生素。
激活剂为特异性活化CIK细胞而设计。激活剂中含有特殊的活性物质，鲎试剂法测定热源两者均为阳性（≥0.5U/ml）。然而，在培养过程中，该成分不会存在于细胞终产品中，因此，细胞产品热源测定应为阴性。
使用该套装，培养起始细胞可以为外周血、胎盘/脐带血或骨髓单个核细胞。一般而言，使用该套装培养14天，细胞总数扩增100倍以上，CD3+/CD56+细胞比例超过30%，CD56+细胞可达到50%以上。
激活剂4°C储存，有效期6个月。辅助激活剂及CIK细胞筛选扩增培养基均4°C储存，有效期12个月。
所有成分均应避光保存，不宜剧烈震荡，以免大分子物质因变性而失活。
技术指标
（一） 激活剂
1. 浅白色，半透明
2. 细菌培养（阴性）
3. 真菌培养（阴性）
（二） CIK优势扩增培养基
1. 浅红色，透明，pH7.1-7.4
2. 细菌培养（阴性）
3. 真菌培养（阴性）
4. 热源（鲎试剂法）≤0.25U/ml
5. NK92细胞生长：良好
产品规格
产品货号 | 名称 | 规格 | 储存条件 | 运输条件 |
1003A | 激活剂 | 1ml | 4°C | 冰袋 |
1008 | IL-15 | 100ug | 4°C | 冰袋 |
1003C | CIK优势扩增液 | 1000ml×2 | 4°C | 冰袋 |
【操作方法】
本操作方法以采集外周血30ml为例，介绍CIK细胞诱导扩增培养的具体方法。请仔细阅读操作手册，尤其注意每个提醒事项。
1. 培养瓶铺板
（1） 可使用Corning公司生产、适于贴壁细胞培养的培养瓶。如货号为431082，底面积为225 cm2的培养瓶。
（2） 将辅助激活剂（30 ml）和激活剂（1 ml）置于37 °C复温10 min，轻轻混匀。按照下表提供的体积，将激活剂和辅助激活剂加入培养瓶中。将其置于37 °C，静置1h后可使用。也可置于4°C，过夜即可使用，或封闭培养瓶，可储存2周。
培养瓶（底面积） | 25 cm2 | 75 cm2 | 175 cm2 | 225 cm2 |
生理盐水体积 | 5 ml | 10 ml | 20 ml | 30 ml |
激活剂体积 | 500 μl | 1000μl | 1500 μl | 2000 μl |
2. 单个核细胞分离、血浆采集及处理
1) 开启水浴箱，调整温度至56 °C，以备灭活补体用。
2) 常规无菌采集抗凝外周血，肝素抗凝。
3) 分离单个核细胞前，将已经预铺板的培养瓶放置37 °C。
4) 常规密度梯度离心法，离心（800 g，25-30 min），收集单个核细胞。建议离心机处于brake-off状态。
5) 吸取上层血浆，56 °C，30 min灭活补体，之后立即置于-20 °C静置2 min，离心（3000 g，至少15-30 min）以去除血小板。
6) 收取单个核细胞层，生理盐水充分混匀。离心洗涤（500 g，15 min）。
注意：吸取单个核细胞层时，吸取过多的上层血浆部分，会导致血小板混杂于单个核细胞群中；吸取过多的Ficoll-Hypaque，会导致粒细胞混杂于单个核细胞中；在洗涤用的生理盐水中，如加入0.38%枸橼酸钠，可减轻血小板的混杂现象。
7) 生理盐水悬浮细胞沉淀，再次离心洗涤（500 g，8-10 min）。
8) 使用CIK细胞扩增培养基悬浮细胞。
取10 ul细胞悬液，加入白细胞稀释液（或3%冰醋酸）90 ul，混匀后计细胞数。将细胞浓度调整为3×106/ml。
3. 细胞培养
1) 取出已经预铺板且置于37 °C孵育的培养瓶，吸净稀释的激活剂。沿培养瓶侧壁加入少量生理盐水，轻轻混匀后吸除。
2) 根据细胞计数结果，将细胞终浓度调整为3×106/ml。单个核细胞悬液中加入IFN-gamma（2000U/ml），自体血浆浓度为2.5-5%。
注：如使用冻存复苏的单个核细胞，建议细胞浓度为5×106/ml。同样的，如使用脐血单个核细胞作为培养起始细胞，建议细胞浓度为5×106/ml.
细胞浓度以及接种培养瓶的表面积，是决定最终培养CIK细胞比例的两个关键因素。我们推荐细胞密度在3×106/ml左右。同时，根据接种细胞体积选择适宜底面积的培养瓶。下表可作为参考。
培养瓶（底面积） | 25cm2 | 75cm2 | 175cm2 | 225cm2 |
细胞悬液总体积 | 2.5-5ml | 7.5-10ml | 15-20ml | 25-30ml |
细胞总数 | 0.75-1.5×107 | 2-3×107 | 4.5-6×107 | 7.5-9×107 |
3) 将细胞悬液加入已经预铺板的培养瓶中，置于37 °C、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养。
4) 培养24小时后，加入重组人IL-2（1000 U/ml）和CIK辅助激活剂（1 μg/ml）。CIK辅助激活剂可以用抗人CD3单克隆抗体替代，使用浓度为（1 μg/ml）。
5) 继续培养。培养液变黄后补充新鲜培养基，新鲜培养基含血浆（2.5-5%）和重组人IL-15（50ng/ml)。补液量一般为补液前原体积的1倍。也可根据细胞悬液和细胞浓度，补充原体积的0.5倍。一般而言，细胞应在预铺板的培养瓶中培养至少一周。Corning生产的225 cm2培养瓶，最大体积可达400 ml。
6) 当原瓶培养基变黄、总体积接近或达到培养瓶最大体积时，补充新鲜的培养基，并分瓶培养。分瓶时，一定将贴壁的细胞转移至新的培养瓶。可以将细胞悬液转移后，再旧培养瓶中加入冷的生理盐水，静置于室温5分钟。之后，轻轻拍打培养瓶侧壁，吹打后转移至离心管收集细胞，平均分配于新的培养瓶中.
7) 补充新鲜培养基，含2.5-5%血浆和IL-15。
8) 每天观察细胞集落大小及细胞密度，及时补充含血浆和IL-15的新鲜培养基，新鲜培养基总量与原来体积相同（等量补液）或为原体积的0.5倍。每次补液前，轻轻拍打培养瓶侧壁，使贴壁的集落悬浮。
9) 主要根据培养基颜色，每天或每隔1-2天补充新鲜的含血浆及细胞因子的CIK细胞扩增培养基。必要时再次转用新的培养瓶扩增。培养12-15天，细胞数达到目的用量后，可进行质量检验，检测合格后收获细胞。
注：细胞培养9-10天后，为了提高扩增效率，可在使用IL-15的基础上，添加IL-2（浓度为500IU/ml).
4. 细胞收获
1) 将细胞转移至500 ml离心管，计细胞数及细胞活力。
2) 离心收获细胞，500 g，15 min。
3) 将细胞转移至250 ml离心管，生理盐水悬浮，离心洗涤，500 g，15 min。
4) 将细胞转移至50 ml离心管，生理盐水悬浮，离心洗涤，500 g，10 min。
5) 用含1%注射用人白蛋白的生理盐水悬浮细胞。
6) 使用孔径为70 μm的细胞筛过滤细胞。
7) 留小样备质检。
8) 将细胞转移至输液袋中。静置于室温。
5. 注意事项
（1）CIK细胞来源于CD8阳性的细胞，在激活剂及IFN-gamma作用下，单核细胞分泌IL-12以促进CD8阳性细胞分化为CD3+/CD56+的细胞（CIK）。因此，在加入抗体和细胞因子之前，IFN-gamma作用时间不应低于24小时。
（2）细胞应尽可能在原培养瓶中培养，或尽可能延长在原培养瓶中的培养时间。这是决定CIK细胞培养是否成功的关键因素。因此，将单个核细胞在原培养瓶中培养超过1周，常可达到较好的效果。可见，补液时机要把握，液体变黄才补液。补液量要明确，原体积的一倍最适宜。
（3）自体血浆制备过程中去除血小板要彻底，过多的血小板会影响CIK细胞分化。自体血浆不够或不适宜培养时，应加用人AB混合血浆，冻融后离心（3000 g，15 min）去除血小板，并添加注射用肝素钠10 U/ml，以防形成凝胶。
