γ/δT细胞培养基

人γ/δT细胞（Clin-SFM®）培养基

(CAS No:1005)

γδ T细胞是T细胞的一个亚群，与传统的T细胞不同，不表达TCRα链和β链，而是表达γ和δ链。这群细胞在外周血中含量很低，只占淋巴细胞的0.5-5%，Vγ9Vδ2 T细胞是最主要的γδ T细胞亚群。与αβ T细胞不同，γδ T细胞活化不需要HLA分子及抗原识别，亦即，γδ T细胞的活化不依赖HLA分子，也就是所谓的“HLA非限制性”。

γδ T细胞具有很强的抗肿瘤活性，这群细胞可以识别肿瘤细胞，迁徙并浸润至肿瘤组织，从而发挥细胞毒及致炎活性。此外，将体外扩增的γδ T细胞输注给患者体内后，细胞可在体内扩增，从而提高使其治疗效果。临床试验研究显示，输注体外扩增培养的γδ T总体上是安全的。培养γδ T细胞，起始细胞一般为新鲜的肝素抗凝的外周血，也可使用冻存复苏的单个核细胞、新鲜的脐血单个核细胞、冻存复苏的脐血单个核细胞、新鲜或冻存复苏的骨髓单个核细胞。

【产品概述】

     本产品是一种化学成分明确、无人和动物血清、无任何动物成分的培养基，适用于人外周血、脐带血、骨髓等来源γ/δT细胞的培养扩增。产品中所有蛋白质成分均为重组技术获得，包括重组人白蛋白、重组人转铁蛋白等多种成分。产品不含抗生素。

使用该套装，培养起始细胞可以为外周血、胎盘/脐带血或骨髓单个核细胞。一般而言，使用该套装培养14-21天，细胞总数扩增100倍以上, 目标细胞细胞（γ/δT细胞）比例超过90%。

   所有成分均应避光保存，不宜剧烈震荡，以免大分子物质因变性而失活。

【技术指标】

（一）γ/δT细胞刺激剂

透明

细菌培养（阴性）

真菌培养（阴性）

热源（鲎试剂法）≤0.25U/ml     

（二）γ/δT细胞扩增培养基

浅红色，透明

pH7.2-7.5

细菌培养（阴性）

真菌培养（阴性）

热源（鲎试剂法）≤0.125U/ml

比重（265-295 mOs/kg）

细胞生长活性（合格）

  培养基组成

操作说明

本操作方法以采集30-50ml外周血为例，介绍γδ T细胞诱导扩增培养的具体方法。请仔细阅读操作手册，尤其注意每个提醒事项。

1.     单个核细胞分离、血浆采集及处理

1) 开启水浴箱，调整温度至56℃，以备灭活补体用。

2) 常规无菌采集抗凝外周血，肝素抗凝。

3) 常规人淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque密度梯度离心，一般用800g，30min。建议关闭离心机刹车（brake off）。

4) 吸取上层血浆，56℃，30分钟灭活补体。之后,将血浆置于-20℃，静置10分钟。离心（3000g,15min）以去除血小板。

5) 收取单个核细胞层，生理盐水充分混匀。离心洗涤。

6) 生理盐水悬浮细胞沉淀，再次离心洗涤。

7) 将单个核细胞悬浮于γδ T细胞扩增培养基中，计细胞数。

2.     细胞培养

1)   单个核细胞悬液中加入自体血浆，自体血浆终浓度为5%-10%。根据细胞计数结果，使用γδ T细胞扩增培养基将细胞终浓度调整为2-3*10⁶/ml，按照100倍稀释加入γδ T细胞刺激因子。

★注意事项：γδ T细胞刺激因子用量，譬如培养体系总体积为10ml，加入刺激因子100μl，以此类推，即为100倍稀释。

2)   将细胞悬液加入培养瓶中，37℃，5%CO₂和100%湿度下培养24-48小时。

★注意事项：此处所述24-48小时，指培养时间一定要超过24小时，但是，不要超过48小时。

3)   加入重组人IL-2至终浓度为1000U/ml，轻轻晃动培养瓶混匀。

4) 继续培养。一般24-48小时后，培养液变黄，补充新鲜γδ T细胞扩增培养基。新鲜培养基含血浆（5%-10%）和IL-2（1000U/ml）。补液量一般为补液前原体积的1倍。

5) 培养一周后，补充新的培养基时，加入γδ T细胞刺激剂，按培养总体积计算，按照100倍稀释添加。同时，添加自体血浆（浓度为5%-10%）及IL-2（1000U/ml）。继续培养。自体血浆不够时，可用人AB血浆或适宜的血清替代物。

6) 每天观察培养基颜色、细胞集落大小及细胞密度，及时补充含血浆（5%-10%）和IL-2（1000U/ml）的新鲜γδ T细胞扩增培养基，新鲜培养基总量一般为原来体积的一倍，即等量补液。每次补液前，轻轻拍打培养瓶侧壁，使贴壁的集落悬浮。一般而言，每天或每2天需要补充新鲜培养基。

7) 培养12-21天，一般为2周，细胞数达到目的用量后，可进行质量检验，之后收获细胞。

3.     细胞收获

1) 将细胞转移至500ml离心管，计细胞数及细胞活力。

2) 离心收获细胞，速度为500g，时间为15分钟。

3) 将细胞转移至250ml离心管，生理盐水悬浮，离心洗涤，500g，15分钟。

4) 将细胞转移至50ml离心管，生理盐水悬浮，离心洗涤，500g，10分钟。

5) 用含1%注射用人白蛋白的生理盐水悬浮细胞。

6) 使用孔径为70μm的细胞筛（cell strainer）过滤细胞。

7) 留小样备质检。

8）     将细胞转移至输液袋中。静置于室温。

人γ/δT细胞培养基优势

1.     本产品是一种化学成分明确、无人和动物血清、无任何动物成分的培养基，以保障产品的安全性。

2.     适用于人外周血、脐带血、骨髓等来源NK细胞的培养扩增。

3.     产品中所有蛋白质成分均为重组技术获得，包括重组人白蛋白、重组人转铁蛋白等多种成分。

4.     培养基质检标准，严格按照上海细胞治疗协会规定的《人临床试验用培养基的标准》执行。

5.     使用该套装，培养起始细胞可以为外周血、胎盘/脐带血或骨髓单个核细胞。一般而言，使用该套装培养14天，细胞总数扩增100倍以上, gamma/delta T细胞比例超过90%。

6.     已完成I类医疗器械备案，备案号为闽泉械备20220014。

质量检验报告书